Katedra Biochemii i Biologii Molekularnej - badania naukowe
Molekularne podstawy chorób zwierząt i ludzi
Rola adhezyn FimH fimbrii typu 1 w patogenezie zakażeń pałeczkami Salmonella.
Zespół: prof. dr hab. Maciej Ugorski, dr hab. Krzysztof Grzymajło, prof. uczelni, lek. wet. mgr Aleksandra Orłowska, lek. wet. Agata Mikołajczyk
Bakterie z rodziny Enterobacteriacae, łącznie z rodzajem Salmonella, posiadają na swojej powierzchni włókienkowate organella noszące nazwę fimbrii typu 1. Fimbrie te odgrywają nie tylko istotną rolę w adhezji bakterii do komórek gospodarza, ale mogą też decydować o ich tropizmie wobec określonych tkanek i narządów, a w przypadku pałeczek Salmonella również i określonych gospodarzy. Stąd uważa się, że są one ważnym czynnikiem warunkującym wirulentność bakterii jelitowych. Fimbrie typu 1 charakteryzują się zdolnością wiązania łańcuchów N-glikozydowych „typu bogatego w mannozę” glikoprotein występujących na powierzchni komórek i w płynach ustrojowych gospodarza. Przy czym w oddziaływaniach fimbrii typu 1 z ligandami bezpośredni udział bierze obecna na ich szczycie adhezyna FimH. W zależności od serowaru, a nawet szczepu Salmonella, białka FimH wykazują niewielkie różnice w sekwencjach aminokwasów (warianty alleliczne), co powoduje, że wiążą się one zarówno z różnym powinowactwem do tych samych glikoprotein lub komórek, jak i mogą oddziaływać z różnymi strukturalnie ligandami. Należy zaznaczyć, że 15 lat temu, kiedy rozpoczynaliśmy badania nad fimbriami typu 1 pałeczek Salmonella, informacje dotyczące budowy i właściwości receptorowych białek FimH, a także ich roli w patogenezie pochodziły głównie z badań nad fimbriami typu 1 Escherichia coli. Stąd celem prowadzonych przez nas badań było i jest poznanie molekularnych podstaw procesów adhezyjnych z udziałem fimbrii typu 1 pomiędzy pałeczkami Salmonella a komórkami gospodarza, co między innymi powinno dać odpowiedź skąd biorą się różnice w tropizmie różnych serowarów pałeczek Salmonella do określonych gospodarzy. Prowadzone przez nas badania mają również na celu wyjaśnienie roli i znaczenia fimbrii typu 1 w patogenezie zakażeń tymi pałeczkami. Obok aspektów poznawczych, badana te mogą mieć duże znaczenie dla rozwoju nowych strategii zapobiegania i leczenia zakażeń pałeczkami Salmonella u ludzi i zwierząt.
Klonowanie i sekwencjonowanie genów fimH S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Abortus-ovis, S. Choleraesuis, S. Dublin, S. Gallinarum biowar Gallinarum i S. Gallinarum biovar Pullorum pozwoliło ustalić, że posiadają one bardzo wysoki stopień homologii (97-99,9%), znajdujący swoje odzwierciedlenie w sekwencjach aminokwasowych białek FimH, różniących się od siebie najwyżej kilkoma resztami aminokwasów. Wykorzystując rekombinowane formy adhezyn FimH wykazano, że zarówno adhezyny FimH pałeczek Salmonella reprezentujących serowary zdolne do zakażania najwyżej kilku gospodarzy (host-restricted), do których zaliczane są S. Abortus-ovis, S. Choleraesuis i S. Dublin, jak i białka FimH pałeczek Salmonella reprezentujących serowary zdolne do zakażania wielu gospodarzy (host-unrestricted), takich jak S. Typhimurium i S. Enteritidis, są aktywnymi adhezynami zdolnymi do wiązania N-glikanów typu „bogatego w mannozę” (Kisiela i wsp., 2006; Grzymajło i wsp., 2013), co z kolei warunkuje adhezję ufimbriowanych pałeczek Salmonella tych serowarów do komórek gospodarza. Posługując się metodą plazmonowego rezonansu powierzchniowego (SPR) wykazano, że wszystkich pięć adhezyn wiąże się z podobnym powinowactwem do modelowych glikoprotein, reprezentując tzw. niskoadhezyjne warianty białka FimH (Kisiela i wsp., 2005; Grzymajło i wsp., 2013). Tym niemniej, adhezyna FimH S. Enteritidis, a więc serowaru zdolnego do zakażania wielu gospodarzy, wiąże się do innych glikoprotein obecnych w błonach plazmatycznych enterocytów świni, owcy i bydła w porównaniu z adhezynami FimH S. Abortus-ovis, S. Choleraesuis i S. Dublin, a więc serowarów zakażających tylko ściśle określonych gospodarzy, co sugeruje, że fimbrie typu 1 mogą odgrywać istotną rolę w zakażeniach określonych gospodarzy przez różne serowary Salmonella (Grzymajło i wsp., 2013). Na udział fimbrii typu 1 w tropizmie pałeczek Salmonella wobec określonych gospodarzy wskazują również badania nad adhezynami FimH S. Gallinarum i S. Pullorum, należącymi do serowaru Gallinarum określanego jako „specyficzny wobec gospodarza” (host-adapted), zakażającego tylko drób grzebiący. Okazało się bowiem, że w odróżnieniu od innych białek FimH, są one niezdolne do wiązania cukrowych ligandów, co spowodowane jest pojedynczą mutacją prowadzącą do zamiany treoniny w pozycji 178, obecnej w aktywnych adhezynach FimH pozostałych serowarów Salmonella, na izoleucynę obecną w obu tych białkach (Kisiela i wsp., 2005). Tak więc, uzyskane wyniki wskazują, że drobne zmiany w strukturze adhezyny, w tym przypadku powodujące brak aktywności wobec cukrowych ligandów, mogą być przyczyną ograniczonej zdolności zakażania innych ptaków i zwierząt, niż drób grzebiący, przez pałeczki serowaru Gallinarum.
Nasze badania sugerują również, że obecność allelicznych wariantów białek FimH fimbrii typu 1 może mieć związek z kliniczną postacią choroby wywołanej zakażeniem określonym serowarem Salmonella. Innymi słowy, określone warianty alleliczne FimH mogą w znaczący sposób wpływać na patogenność pałeczek Salmonella wobec ich gospodarzy. Wykorzystując zmutowane szczepy pałeczek S. Enteritidis z „wyłączonymi” genami fimH, którymi zakażano myszy, wykazano, że adhezyna FimH fimbrii wiążąca N-glikany typu „bogatego w mannozę”, opóźnia rozwój uogólnionej postaci zakażenia u myszy. Świadczy to o tym, że aktywne fimbrie typu 1 mogą być czynnikiem ograniczającym zakażenia tym serowarem do światła przewodu pokarmowego, co znajduje swoje odzwierciedlenie w przebiegu infekcji wywoływanych przez pałeczki S. Enteritidis, przebiegające zwykle w postaci zapalenia żołądka i jelit (Kuźmińska-Bajor i wsp., 2015). Z kolei, wykorzystując zmutowane szczepy pałeczek S. Gallinarum z „wyłączonym” genami fimH lub ekspresjonujące białko FimH S. Enteritidis, którymi zakażano 1-dniowe kurczęta, wykazano, że ekspresja adhezyny FimH pozbawionej zdolności wiązania struktur cukrowych ułatwia pałeczkom S. Gallinarum kolonizację narządów wewnętrznych kurcząt. To z kolei sugeruje, że dotychczas uważane za „nieaktywne”, fimbrie typu 1 S. Gallinarum mogą być czynnikiem ułatwiającym rozwój uogólnionej postaci salmonellozy, zwiększając tym samym wirulentność tych pałeczek (Kuźmińska-Bajor i wsp., 2012).
Aktualnie prowadzone badania koncentrują się wokół zagadnień dotyczących udziału białek FimH fimbrii typu 1 w tropizmie pałeczek Salmonella do określonych gospodarzy, co wymaga identyfikacji specyficznych receptorów na komórkach gospodarza, do których wiążą się te adhezyny, a także roli białek FimH w patogenezie zakażeń pałeczkami S. Gallinarum.
Poszukiwanie nowych czynników wirulencji pałeczek Salmonela enterica z wykorzystaniem technik „Omics” (omicznych)
Zespół: Rafał Kolenda, Maciej Ugorski
Projekt we współpracy z: Peterem Schierackiem (BTU Cottbus-Senftenberg, DE), Gordonem Douganem (Sanger Institute, UK), Josefine Bartholdson Scott (Sanger Institute, UK), Dereckiem Pickardem (Sanger Institute, UK), Michałem Burdukiewiczem (Politechnika Warszawska), Aamirem Ali (National Institute for Biotechnology and Genetic Engineering, Pakistan), Sebastianem Guntherem (University of Greifswald, DE), Torstenem Semmlerem (Robert Koch Institute, DE)
Postęp w zakresie technologii Omics zapewnił nam nowe narzędzia do badań patogenów i zakażeń przez nie powodowanych. Adhezja i/lub inwazja do komórek różnych nabłonków są jednymi z pierwszych kroków w patogenezie zakażeń bakteryjnych. Bakterie rozwinęły różne strategie adhezji i inwazji do komórek gospodarza, a do badania tych interakcji stosuje się modele adhezji i inwazji in vitro. Obecnie stosowane metody nie pozwalają na równoczesną analizę wielu izolatów/ szczepów bakteryjnych, dlatego pierwszym z celów tych badań było opracowanie zautomatyzowanego systemu pozwalającego na wysokoprzepustową analizę adhezji i inwazyjności dużej liczby izolatów pałeczek Salmonella z komórkami nabłonkowymi. Wykorzystując technologię „VideoScan” opracowaną przez grupę prof. Schieracka, określono w sposób ilościowy adhezję i inwazję izolatów klinicznych pałeczek Salmonella enterica serowar Typhimurium, Enteritidis, Dublin, Choleraesuis i Gallinarum do ludzkich komórek Caco-2 raka okrężnicy, świńskich komórek IPEC-J2 nabłonka jelitowego, kurzych komórek CHIC8-E11 nabłonka jelitowego. Następnie, genomy izolatów pałeczek Salmonella o najwyższej i najniższej infekcyjności wobec tych komórek zostały zsekwencjonowane z zastosowaniem sekwencjonowania nowej generacji w ramach współpracy z prof. Douganem. Aktualnie prowadzona jest analiza porównawcza tych genomów, której celem jest wytypowanie genów najsilniej związanych z właściwościami adhezyjnymi i inwazyjnymi pałeczek Salmonella należących do różnych serowarów.
Izolaty pałeczek Salmonella wykorzystane w testach adhezyjnych/inwazyjnych zostały użyte w kolejnym projekcie, którego celem było określenie wpływu zmienności genetycznej tychże izolatów na ekspresję fimbrii typu 1 (T1F). Posługując się systemem „VideoScan”, ekspresja T1F została wykazana u ponad 80% badanych izolatów, przy czym więcej izolatów należących do serowarów o szerokim zakresie gospodarzy ekspresjonowało T1F niż izolaty należące do serowarów o wąskim zakresie gospodarzy. Genomy bakterii o najwyższej i najniższej (lub braku) ekspresji T1F zostały zsekwencjonowane z ramach współpracy z prof. Sebastianem Guntherem i dr Torstenem Semmlerem. Ponadto, 4 izolaty pałeczek Salmonella zostały poddane analizie transkryptomu przy użyciu metody RNAseq. Realizacja tego projektu pozwoli zidentyfikować nowe geny odpowiedzialne za regulację ekspresji T1F.
Geny zidentyfikowane w ramach obu projektów poddane zostaną weryfikacji z wykorzystaniem odpowiednich mutantów bakteryjnych i modeli komórkowych w badaniach in vitro oraz modelach zwierzęcych in vivo. Analiza funkcjonalna tych genów dostarczy nowych informacji na temat patogenezy zakażeń pałeczkami Salmonella i pomoże w opracowaniu nowych strategii prewencji i leczenia chorób powodowanych przez pałeczki Salmonella.
Rola glikosfingolipidów w progresji raka sutka człowieka i psa.
Zespół: prof. dr hab. Maciej Ugorski, dr inż. Jarosław Suchański, dr inż. Maciej Zacharski
Analiza ekspresji genów w przerzutach raka gruczołu piersiowego, w której wykorzystano genomikę funkcjonalną, wykazała, że każdy, narządowo-swoisty przerzut charakteryzuje się specyficznym profilem ich ekspresji. W badaniach tych stwierdzono, że wśród 6 genów, których ekspresja jest znacznie podwyższona tylko w przerzutach raka gruczołu piersiowego do płuc, znajduje się gen UGT8 kodujący enzym: UDP-galaktoza:ceramid galaktozylotransferaza, odpowiedzialny za syntezę galaktozyloceramidu (GalCer), glikosfingolipidu znanego przede wszystkim jako składnik mieliny. Stąd celem prowadzonych przez nas badań jest określenie roli UGT8 i GalCer w progresji raka gruczołu piersiowego. Jeżeli prowadzone przez nas badania potwierdzą tezę o bezpośrednim ich udziale w zwiększeniu potencjału przerzutującego komórek tego nowotworu, mogą one stać się nowymi celami dla terapii przeciwnowotworowej.
W badaniach własnych wykazano, że poziom ekspresji UGT8 w komórkach raka gruczołu piersiowego jest wyznacznikiem ich złośliwości i może być wykorzystany jako nowy, dodatkowy marker prognostyczny w tym nowotworze (Dziegiel i wsp., 2010). Posługując się metodą immunocytochemicznego znakowania skrawków tkankowych i PCR w czasie rzeczywistym stwierdzono istotny wzrost ekspresji UGT8 w tkance nowotworowej pochodzącej z przerzutów do płuc w porównaniu z guzami pierwotnymi, istotny wzrost ekspresji UGT8 w guzach pierwotnych o stopniu złośliwości G3 w stosunku do guzów o stopniu G1 i G2, oraz statystycznie istotne różnice w ekspresji UGT8 pomiędzy guzami pierwotnymi nie dającymi przerzutów do węzłów chłonnych, a guzami przerzutującymi. Podobnie, w przypadku raka sutka u suk, wyższy poziom UGT8 obserwowano w przypadku gruczolakoraków w porównaniu z łagodnymi gruczolakami (Nowak i wsp., 2013). Te obserwacje znalazły potwierdzenie w badaniach przeprowadzonych na modelu myszy bezgrasiczych. Wykorzystując odpowiednio modyfikowaną linię komórek raka gruczołu piersiowego, stwierdzono istotny wpływ UGT8 i GalCer na apoptozę, proliferację, zdolność do wzrostu w postaci guza i potencjał przerzutujący tych komórek piersiowego, co wydaje się tłumaczyć dlaczego w badaniach klinicznych nadekspresja UGT8 koreluje ze złośliwością tego nowotworu (Owczarek i wsp., 2013). Z pomocą tego i kolejnych modeli komórkowych wykazano, że udział tego enzymu w progresji raka gruczołu piersiowego do bardziej złośliwego fenotypu, związany jest ze zwiększoną opornością komórek na apoptozę wywoływaną stresem, którego źródłem jest mikrośrodowisko guza nowotworowego. Pokazano, że komórki ze zwiększoną ekspresją UGT8, i tym samym akumulacją GalCer, charakteryzują się obniżoną wrażliwością na takie czynniki jak hipoksja oraz wolne rodniki, i co ciekawe, na szeroko stosowane w leczeniu tego nowotworu cytostatyki: doksorubicynę, paklitaksel i etopozyd. Wykorzystując metodę profilowania ekspresji genów z zastosowaniem macierzy DNA wykazano, że zwiększona oporność takich komórek na apoptozę związana jest ze zmianami w ekspresji genów TNFRSF1B, TNFRSF9 oraz BCL2, co zostało potwierdzone na poziomie zarówno mRNA jak i białka. Zmiany te korelowały z opornością komórek raka gruczołu piersiowego na apoptozę, jako że obserwowano wzrost ekspresji receptorów dla TNFα pełniących w komórkach rolę pro-apoptotyczną, oraz spadek ekspresji białka Bcl2 pełniącego rolę anty-apoptotyczną. Wykazano również, że w przypadku komórek z wysoką ekspresją UGT8, procent komórek apoptotycznych po potraktowaniu TNFα jest istotnie mniejszy w porównaniu z komórkami z niską ekspresją UGT8, co jednoznacznie potwierdziło związek pomiędzy ekspresją receptorów TNFR zależną od GalCer, a podatnością komórek raka gruczołu piersiowego na apoptozę. Otwartym pozostaje natomiast pytanie, w jaki sposób GalCer wpływa na obniżenie ekspresji receptorów TNFR oraz wzrost ekspresji Bcl-2 na poziomie ich transkrypcji.
Badania nad rolą UGT8 i GalCer w progresji raka gruczołu piersiowego prowadzone są wspólnie z Instytutem Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN im. L. Hirszfelda we Wrocławiu oraz Uniwersytetem Medycznym im. Piastów Śląskich we Wrocławiu.
Molekularne podstawy niewydolności serca
Zespół: dr hab. Liliana Kiczak, prof. uczelni, dr inż. Maciej Zacharski
W ramach projektu Wrovasc – Zintegrowane Centrum Medycyny Sercowo-Naczyniowej stworzono świński model kardiomiopatii indukowanej tachykardią (tachycardia-induced cardiomyopathy, TIC). Tego rodzaju zwierzęcy model niewydolności serca umożliwia badanie naturalnej historii NS, zwłaszcza wczesnych etapów rozwoju choroby, które wciąż są mało poznane (Pasławska 2011).
Przeprowadzone badania wskazują na zmiany w poziomie i aktywności różnych molekularnych elementów układu parasympatycznego w rdzeniu przedłużonym, co świadczy o czynnościowym połączeniu pomiędzy rdzeniem przedłużonym a sercem podczas rozwoju NS. Co ważne, bardzo wczesne zmiany obserwowane w układzie parasympatycznym w rdzeniu przedłużonym poprzedzały wzrost napięcia układu sympatycznego, objawiający się wysokim poziomem katecholamin w krążeniu (Tomaszek i wsp. 2013). Wydaje się, że we wzroście poziomu katecholamin w krążeniu znaczący udział biorą nadnercza (Tomaszek 2015).
Kolejnym obszarem zainteresowań jest ocena udziału czynników prozapalnych, takich jak indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS) oraz stresu oksydacyjnego w rozwoju NS. W przeciwieństwie do gryzoni, indukowalna syntaza tlenku azotu (iNOS) okazała się być konstytutywnie ekspresjonowana w sercu świni (lewej komorze). Poziom iNOS spadał razem z rozwojem NS w naszym modelu TIC. Co zaskakujące, stwierdziliśmy brak oznak stanu zapalnego i podwyższonego stresu oksydacyjnego w mięśniu sercowym zwierząt z NS. Można zatem przypuszczać, że u dużych ssaków przebieg NS nie jest związany z aktywacją procesów zapalnych w obrębie miokardium, a stres oksydacyjny prawdopodobnie jest ograniczony do mitochondriów (Paslawska 2016).
W obrębie zainteresowań znajduje się również przebudowa mięśnia sercowego w procesie rozwoju NS. W procesie tym zasadniczą rolę odgrywa macierz zewnątrzkomórkowa (ang. extracellular matrix, ECM) oraz metaloproteinazy (MMP). Wykazaliśmy, że wysokocząsteczkowe kompleksy zawierające MMP9, MMP2, NGAL (lipokalina neutrofilową związaną z żelatynazą) i TIMP1 (tkankowy inhibitor metaloproteaz 1) są obecne zarówno w zdrowym, jak i niewydolnym miokardium świń. Nie występują one w mięśniach szkieletowych. Są one proteolitycznie nieaktywne, ale mogą spontanicznie uwalniać aktywne formy MMP9 i MMP2. Prawdopodobnie wysokocząsteczkowe kompleksy zawierające metaloproteinazy mogą pełnić rolę rezerwuaru aktywnych MMP w mięśniu sercowym (Kiczak 2013, Kiczak 2014). Badania różnic w przebudowie serca u obu płci wykazały, że istotne poszerzenie lewej komory oraz indukcja proprzerostowego programu transkrypcji genów występuje tylko u samców świń. Całkowita aktywność żelatynolityczna w lewej komorze jest wyższa u samców niż u samic (niezależnie od niewydolności serca), w trakcie rozwoju niewydolności u samców aktywność żelatynolityczna w lewej komorze serca maleje. U samic lewa komora rozszerza się znacznie wolniej, bez widocznych oznak ekscentrycznego przerostu, z zachowaniem początkowych funkcji rozkurczowych. Wyniki naszych badań wykazały, iż niektóre aspekty przebudowy ECM istotnie zależą od płci. W planowaniu doświadczeń z użyciem zwierzęcych modeli NS należy brać pod uwagę płeć zwierząt doświadczalnych, gdyż pewne parametry badane u samic i u samców mogą być efektem tych istotnych, naturalnych różnic (Kiczak 2015).
Oporność wielolekowa mikroorganizmów
Zespół: dr hab. Anna Kołaczkowska
Oporność mikroorganizmów (bakterii, grzybów, wirusów, pasożytów) na obecnie stosowane leki staje się coraz poważniejszym ogólnoświatowym problemem zdrowia publicznego. Infekcje przez nie powodowane są długotrwałe i trudne do wyleczenia. Najczęstszą przyczyną infekcji grzybiczych są oportunistyczne patogeny z rodzaju Candida takie jak C. albicans czy C. glabrata. Infekcje grzybicze powodowane przez C. glabrata najliczniej występują u pacjentów z upośledzonym układem immunologicznym pod postacią kandydoz powierzchniowych oraz zakażeń ogólnoustrojowych. Charakterystyczną cechą drożdżaków C. glabrata jest ich naturalna, zwiększona tolerancja wobec leków z grupy azoli. Łatwo też nabywają na nie oporność w trakcie leczenia. Za główny mechanizm oporności naturalnej jak i nabytej C. glabrata powszechnie uważa się zwiększoną produkcję transporterów błonowych z rodziny ABC, wypompowujących leki na zewnątrz komórki. Jednak, oprócz zwiększonej ekspresji ABC transporterów, na udział w powstawaniu oporności ma wiele innych genów. Jednym z głównych celów badawczych jest poznanie roli słabo do tej pory scharakteryzowanych genów kodujących białka z rodziny LTE (Lipid Translocating Exporters) oraz loci zaangażowanych w remodelowanie ściany komórkowej, czy wpływających na status mitochondrialny, które biorą udział w procesie powstawania oporności. Ponadto, określenie szlaków przekazywania sygnału z nimi powiązanych.
